Sin duda su carrera despegó en 1993 cuando le dieron el papel protagonista en la serie de FOX, The X-Files, convirtiéndolo en una de las caras más conocidas de la pequeña pantalla. En la serie interpretaba al agente especial del FBI Fox Mulder, obsesionado por la abducción de su hermana pequeña Samantha que sucedió cuando él era un niño. La serie gira en torno a la resolución de los Expedientes X, además de intentar descubrir toda una conspiración del gobierno que intenta ocultar la verdad sobre lo que en realidad ocurre. Su fiel compañera es Dana Scully, interpretada por Gillian Anderson. Ambos se convirtieron en la pareja más famosa de la televisión por la diferencia de pensamientos de ambos y lo bien que se compenetraban, teniendo en vilo a millones de fans deseosos de ver un acercamiento cariñoso entre ambos. El episodio donde Mulder y Scully se besan por primera vez fue uno de los más vistos de la historia. Casi desde el principio la serie tomó el apelativo de serie de culto, enganchando a millones de personas en todo el mundo, deseosos de saber lo que realmente oculta el gobierno y saber si hay alguien ahí aparte de nosotros. La serie duró nueve temporadas, pero Duchovny decidió que el personaje era tan inmenso que podría encasillarse y decidió abandonar la serie al finalizar la séptima temporada. Durante la octava temporada se le pudo ver en algunos episodios y tan solo salió en el último capítulo de la novena y última temporada para poner el broche de oro a una de las mejores series de la historia de la televisión. Además de actuar, David escribió y dirigió varios episodios de The X-Files.